BVTS - Projektai

Pagrindinė mūsų skyriaus darbų kryptis yra priešvėžinių vaistų kūrimas, naudojant struktūrinės biotermodinamikos metodus. Tyrimams skyriuje pasirinkome žmogaus karboanhidrazių bei žmogaus šaperonų (pirmiausia Hsp90) baltymų šeimas. Šie baltymai- mūsų tyrimų taikiniai, jiems ieškome galimų inhibitorių,- naujų mažos molekulinės masės junginių. Šios naujos molekulės projektuojamos kompiuteriu, po to sintetinamos organinės chemijos specialistų. Vėliau biofizikiniais metodais tiriamas jų slopiklinis poveikis.

Skyriuje naudojame ir vystome naujoviškus tyrimo metodus ir termodinaminį požiūrį į baltymų-ligandų sąveiką. Šalia laisvosios Gibso energijos, entalpijos, entropijos ir šiluminės talpos, tiriame ir baltymo-ligando molekulių tūrio pokyčius bei spūdumą.

 
Karboanhidrazės kaip priešvėžinių vaistų taikinys

Karboanhidrazės (CA), cinko joną turinčių fermentų grupė, dalyvauja daugelyje fiziologinių ir patologinių procesų: gliukoneogenezėje, lipogenezėje, šlapalo sintezėje, auglių vystymesi. Be atrasto gydomojo CA slopiklių poveikio glaukomai, diuretinio veikimo, neseniai paaiškėjo, kad galima naudoti minimus preparatus gydant nutukimą, vėžį ir užkrečiamas ligas (Supuran, 2007). 
CA katalizuoja CO2 virsmo į hidrokarbonato jonus ir protonus reakciją. Žmogaus organizme aptinkamos 15 CA fermentų izoformų. Trys iš jų yra neaktyvūs į CA panašūs baltymai, neturintys cinko jono ir todėl nekatalizuojantys CO2 hidratavimo reakcijos. 12 aktyviųjų CA izoformų įvairiose audiniuose ekspresuojama skirtingais kiekiais, skiriasi taip pat ir jų fermentiniai aktyvumai. Sukurta jau nemažai CA slopiklių. Tai daugiausia pakaitiniai sulfonamidai. Tačiau dauguma esamų slopillių nėra pakankamai selektyvūs taikiniams- CA izoformoms, pvz., priešvėžiniams taikiniams,- hCAIX ir hCAXII.
Mūsų skyriuje sukurta nauja CA slopiklių klasė, selektyvi hCAIX, hCAI ir hCAII. Šie inhibitoriai jungiasi prie CA su nanomolių eilės disociacijos konstantomis ir yra gana selektyvūs.

CA inhib 1hCA2 03

Pav.1 Bendra CA inhibitorių formulė ir hCAII-inhibitoriaus komplekso kristalinė struktūra. Struktūra išspręsta bendradarbiaujant su Sauliumi Gražuliu (Baltymų-nukleorūgščių sąveikos tyrimo skyrius)

 

Hsp90 šaperono inhibicija

Hsp90 - molekulinis šaperonas, atsakingas už daugelio baltymų taisyklingą susivyniojimą. Tarp Hsp90 baltymų-klientų yra daugelis onkogenų produktų.
Mus labiausiai domina Hsp90 veikimo mechanizmas ir inhibitoriaus surišimo termodinamika. Skyriuje suprojektuota ir susintetinta nauja inhibitorių grupė, savo struktūra panaši į žinomą gamtinį Hsp90 inhibitorių radisikolį. Taip pat sukurtas naujas modelis, paremtas terminiu baltymo denatūravimo poslinkiu. Šis modelis įgalina tiksliai nustatyti Hsp90-ligandų surišimo konstantas, gerai aprašo Hsp90-radisikolio dvigubą terminį perėjimą.

Hsp90 radic 1 lt
 

Baltymų stabilumo charakterizavimas, esant įvairioms pašalinėms medžiagoms

Rekombinantinių baltymų stabilumui nustatyti mes naudojame miniatiūrizuotą aukšto našumo terminio poslinkio analizę (taip pat vadinamą ThermoFluor®). Šios analizės metu matuojame baltymų lydymosi temperatūrą, sekdami pridedamų dažų (pvz. 1,8-anilin-naftalen-sulfonato) fluorescenciją. Paveikslėlyje pavaizduotas hCAII stabilumas įvairiuose buferiuose, esant skirtingam pH:
CA2 char 1 lt
Vienoje plokštelėje galime nustatyti įvairių medžiagų įtaką baltymo stabilumui, sunaudodami vos kelis mikrogramus rekombinantinio baltymo. Tomis medžiagomis gali būti osmolitai, organiniai tirpikliai, aminorūgštys, metalų jonai, lipidai bei kitos cheminės ir bioaktyvios medžiagos. Ši technologija palengvina optimalių tiriamų baltymų laikymo ir panaudojimo sąlygų paieškas.
 

Ligando surišimo konstantų nustatymas, naudojant terminio poslinkio metodą

Terminio poslinkio metodas leidžia mums dideliu našumu, taupiai vartojant tiriamus baltymus, nustatyti ligandų surišimo konstantas. Greta naudodami izoterminio titravimo kalorimetrijos metodą, mes nustatome visus reikalingus termodinaminius ligando surišimo reakcijos parametrus,- laisvąją Gibso energiją, entalpiją, entropiją, šiluminę talpą. Šie duomenys panaudojami ieškant potencialių gerai besijungiančių ligandų.

hCA13 binding 1

Pav 4. hCAXIII ligandų surišimo konstantų nustatymas.

 

Baltymų denatūravimo aukštu slėgiu tyrimai

Tyrimai aukštame slėgyje pateikia daugelį termodinaminių parametrų, kurių negalime surasti kitais metodais. Tai- baltymo natyvios ir denatūruotos formos molinis tūris, plėtimosi koeficientas, spūdumas. Ligando surišimas įtakoja baltymo terminį ir slėgio stabilumą. Slėginio stabilumo matavimų informacija pateikia mums naujas galimybes nustatant ligando surišimo termodinaminius parametrus.

Zigmas 1

Pav.5. Zigmantas Toleikis atlieka baltymų denatūravimo slėgiu eksperimentą.

 

Paslaugos

BVTS linkęs bendradarbiauti projektuose, kur galėtume panaudoti mūsų patirtį nustatant rekombinantinių baltymų stabilumą bei baltymų- ligandų jungimosi termodinaminius parametrus. Galime apibūdinti tiriamo baltymo terminį stabilumą daugeliu sąlygų, naudodami dešimčių mikrogramų eilės baltymo kiekius.